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近日，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所使用融智生物QuanSNP核酸質(zhì)譜平臺建立了肺炎支原體（MP）多位點(diǎn)SNP分型與大環(huán)內酯類(lèi)抗生素（ML）耐藥同時(shí)檢測的方法。相關(guān)研究結果已經(jīng)發(fā)表在iScience上，文章標題為“A multisite SNP genotyping and macrolide susceptibility gene method for Mycoplasma pneumoniae based on MALDI-TOF MS”（?https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102447）。文章的第一作者為趙飛研究員，通訊作者為肖迪研究員，融智生物作為合作單位參與其中。
?肺炎支原體（MP）是引起兒童及成人呼吸道感染的重要病原菌，每年約10%-30%的社區獲得性肺炎病例由其感染引起。大環(huán)內酯類(lèi)抗生素（ML）是臨床MP感染治療的一線(xiàn)藥物，尤其在兒童中使用非常普遍。2000年以后，國際上ML耐藥MP比例持續升高，中國MP的ML耐藥率一直居高不下。MP的ML耐藥與其23S rRNA基因突變密切相關(guān)，其中2063、2064突變與ML高水平耐藥相關(guān)，2617突變與低水平耐藥相關(guān)。因此，上述位點(diǎn)的基因檢測成為可替代ML體外藥敏實(shí)驗，快速檢測MP的ML耐藥的技術(shù)。目前耐藥基因檢測最常用的方法有熒光PCR的高分辨率熔解曲線(xiàn)（HRMA）法、限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法和焦磷酸測序法。
基因分型是MP分子生物學(xué)與流行病學(xué)特征研究的重要手段。MP基因組高度保守，菌株間相似度高達99%，基于單核苷酸變異和基因插入缺失，肺炎支原體明確分為兩種基因型?；趐1基因的PCR-RFLP分型、基于pl基因的VNTR分型以及基于MPN459/MPNA5864基因的熒光PCR技術(shù)是目前常用的MP基因分型技術(shù)。盡管操作相對簡(jiǎn)便，但靶位點(diǎn)單一導致區分能力有限，是此類(lèi)方法的劣勢。多位點(diǎn)的MLVA及MLST分型技術(shù)相繼報道，有效提升了MP分型能力。然而，上述基因分型技術(shù)耗時(shí)且技術(shù)要求高，使其應用受到限制。如果再加上MP耐藥基因檢測，則MP基本分子生物學(xué)特征檢測過(guò)程更加繁瑣耗時(shí)，因此需要研發(fā)新型快速、低成本的分型與耐藥檢測技術(shù)。
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)近年來(lái)被用于單位點(diǎn)核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測。其檢測原理是，首先使用多重PCR擴增含SNP靶位點(diǎn)的目的基因；其次，通過(guò)特異性質(zhì)量探針進(jìn)行SNP位點(diǎn)延伸，最后通過(guò)MALDI-TOF MS鑒定不同質(zhì)量探針?lè )肿恿康玫綑z測結果。
基于MALDI-TOF MS的SNP分型分析，在手足口病毒、HBV檢測以及HPV分型等方向已經(jīng)廣泛應用，并且具有取代傳統鑒定技術(shù)的潛力?；贛ALDI-TOF MS的SNP分析方法具有高通量、快速、多靶標同時(shí)檢測的優(yōu)點(diǎn)，是當前最有應用前景的生物分子技術(shù)之一。
圖1.?基于MALDI-TOF MS技術(shù)用于MP分型和耐藥基因檢測實(shí)驗流程圖（左）；
融智生物QuanSNP核酸質(zhì)譜平臺（右）
在該研究中，開(kāi)發(fā)了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS方法同時(shí)檢測MP的6個(gè)分型靶位點(diǎn)和3個(gè)ML耐藥基因。該方法對20種非MP菌株核酸均未檢測到質(zhì)量探針延伸信號，表明該方法具有良好的特異性；肺炎支原體M129菌株用于檢出限測試，該方法最低檢出限為100拷貝/反應。使用141株臨床MP菌株的核酸樣本進(jìn)行分型與耐藥分析，QuanSNP檢測結果與測序和藥敏結果一致率100%，表明該方法具有很好的鑒定準確性。在30例MP陽(yáng)性臨床樣本中，25例中檢測到9個(gè)分型與耐藥SNP位點(diǎn)，檢測陽(yáng)性率為83.3%，表明該方法具有良好的臨床標本分型和耐藥檢測能力，適用于MP類(lèi)生長(cháng)緩慢病原體的快速分型與耐藥檢測。
圖2-A 9個(gè)MPE質(zhì)量探針的質(zhì)譜圖
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?圖2-B?基于肺炎支原體菌株質(zhì)量探針延伸后的質(zhì)譜圖
基于融智生物的QuanSNP核酸質(zhì)譜平臺，中國疾控中心傳染病預防控制所開(kāi)發(fā)了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS的方法，同時(shí)檢測MP多位點(diǎn)分型以及ML耐藥基因，該方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性強、低成本以及高通量的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)現MP多位點(diǎn)SNP分型與ML耐藥基因的同時(shí)檢測，分型能力強且兼顧兩型菌株，耐藥位點(diǎn)檢測全面且準確，適用臨床標本檢測。同時(shí)，核酸質(zhì)譜平臺可滿(mǎn)足客戶(hù)的不同檢測需求，在微生物鑒定、分型以及耐藥檢測中具有良好的應用前景。
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