MALDI 質(zhì)譜成像技術(shù)因其獨特的技術(shù)優(yōu)勢，包括實(shí)現多樣的分子 類(lèi)型，復雜樣本上的分子空間分布等，已被多領(lǐng)域的研究引用
近年來(lái)，在檢測樣本表面目標分子的空間分布上擁有強大能力的 MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization) 質(zhì)譜成像技術(shù) (Imaging Mass Spectrometry, IMS) 越來(lái)越受關(guān)注。MALDI-IMS 已 被多種科研領(lǐng)域應用，并在多樣性分子的可視化檢測上不斷突破，其中檢測的分子種類(lèi)已涵蓋各種有機 小分子，化學(xué)藥物，脂類(lèi)，多肽及蛋白等 1,2。無(wú)需標記，在某些分子檢測上甚至無(wú)需任何復雜的前處理， 就可以同步得到多個(gè)或多種類(lèi)分子在復雜樣本中，精確且高分辨率的空間表達，這些優(yōu)勢毋庸置疑地成 為了 MALDI-IMS 的標志。MALDI 質(zhì)譜成像技術(shù)不僅提供精確的分子質(zhì)量分布譜圖信息，還能夠在復雜 組織的結構上呈現微米級空間分辨率的分子表達特異性，這些結果一方面為分析和觀(guān)察目標物的區域性 分布及組織在分子級別的結構性差異等方面帶來(lái)新的見(jiàn)解和發(fā)現；另一方面，作為創(chuàng )新的成像技術(shù)，可 在臨床領(lǐng)域輔助判斷受損或病變組織區域的分子構成和變化機制，并潛在輔助尋找腫瘤標記物等；同時(shí)， 基于特異性分子的 MALDI 質(zhì)譜成像，還可以精準協(xié)助個(gè)體化疾病診斷及用藥和護理等方向的指導。 隨著(zhù)逐漸對質(zhì)譜成像技術(shù)需求的提高，標準化的檢測流程，包含樣本前處理與儀器采集性能在內 的方法學(xué)優(yōu)化成為了首當其沖的攻克目標。本應用介紹了一種高空間分辨率脂質(zhì)質(zhì)譜成像采集的操作流 程，該操作流程使用基質(zhì)升華法對組織進(jìn)行前處理，在 MALDI-TOF MS (QuanTOF) 上采集質(zhì)譜數據。 MALDI-TOF MS (QuanTOF) Imaging 的成像采集滿(mǎn)足 7S 指標 (Speed, Specificity, Spatial Resolution, Sensitivity, Stability, Simplicity & Size)3,4，為快速高效地達成高分辨、高靈敏的成像采集奠定了基礎。通 過(guò)我們的前處理及采集方法，可以快速且高效地得到靈敏度，重現性和分辨率均良好，可信度較高的脂 類(lèi)成像數據。通過(guò) QuanIMAGE 質(zhì)譜成像系統對數據的進(jìn)一步處理和分析，可以得到清晰的多樣性脂類(lèi) 分子在組織內微米級別的結構分布成像，基于譜圖的疊加與對比，成像的同源性分析等多種功能的應用， 為進(jìn)一步分析目標脂質(zhì)的區別性表達帶來(lái)潛在的應用價(jià)值。
實(shí)驗
?樣本前處理直接影響質(zhì)譜成像數據的采集與分子成像的效果。本應用中，根據我們優(yōu)化的組織前處理操作流程，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗 驗證其穩定的高分辨譜圖及成像結果，確認了其在脂質(zhì)分子范圍內成像應用的實(shí)用性
A typical MSI workflow detailing steps from study design to reporting. (Figure modif ied from Swales etal., 20182 )
【樣本制備】
MALDI質(zhì)譜脂類(lèi)成像的前處理主要分為三步：樣本切片，基質(zhì)升華和再水合。
【樣本切片】
質(zhì)譜成像推薦使用新鮮組織樣本。新鮮解剖組織 (六周大鼠完整腦組織) 去除表面 明顯的殘余血跡后，立即放入液氮速凍 (或者異戊烷處理)，5 min - 10 min 后將組織放 于-20℃ 恒定溫度環(huán)境中 (冰箱/冷凍切片機)，繼續冷凍至少 1 小時(shí)。 準備就緒，使用OCT冷凍組織包埋劑 (Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 固定組織，使用冷凍切片機 (CM1900/3050: Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 進(jìn)行組織樣本切片，切片厚度控制在10 μm-12 μm。使用ITO導電玻璃 (Intelligene Biosystems, Qingdao, China) 貼附切好的樣本切片，在低溫的冷凍切片機內使用指腹 在切片背側加熱至完全融化貼合，以避免組織發(fā)生卷曲錯位。
【基質(zhì)升華】
樣本切片在真空干燥器 (悅城) 中進(jìn)行15分鐘干燥后，固定于升華裝置內 (ACE Glass) 進(jìn)行升華處理： 基質(zhì)：300 mg 1,5-DAN (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, U.S.A) 真空條件：4E-2 mbar 升華溫度：145℃ 2 mins + 150℃ 4 mins (6-min-process)
【再水合】
升華后樣本切片避光密封于切片盒/50 mL離心管內 (使用Parafilm進(jìn)行密封)，放 入-20℃冰箱2小時(shí)5 。再水合后樣本在切片盒內可使用鋁膜避光真空封裝，4℃環(huán)境內 保存，三天內完成樣本采集。
【質(zhì)量校準】
Standard Kit：Bradykinin Fragment 1-7 & Angiotensin II, CHCA
【樣本檢測】
再水合后樣本/從真空密封狀態(tài)取出的樣本可進(jìn)行短時(shí)間的常溫恢復及真空干燥， 樣本放置于MALDI-TOF MS (QuanTOF) 成像載靶器上，通過(guò)控制器軟件(QuanTOF Controller)操作載入儀器內。選擇采集區域，設置采集方法后，提交采集任務(wù)進(jìn)行自 動(dòng)數據采集。采集完成后數據通過(guò)成像系統軟件 (QuanTOF Viewer) 進(jìn)行成像分析。
【MALDI-TOF MS 條件】
采集機型：QuanTOF
采集模式：線(xiàn)性離子模式 (Linear Ion Mode)
聚焦質(zhì)量：950 m/z
激光頻率：5,000 Hz
質(zhì)量范圍：100-1,500 m/z
加速電壓：10 kV
檢測電壓：-0.8 kV
激光能量：8 μL
激光直徑：10 μm
空間分辨率：10 μm
單譜圖激光轟擊次數：10 shots
結果與討論
高空間分辨率的質(zhì)譜成像結果普遍需要超長(cháng)的采集時(shí)間，甚至需要把組織分割為多個(gè) 區域，先后加載到質(zhì)譜儀中采集，以降低基質(zhì)在真空下?lián)]發(fā)/升華的影響（較大面積的組 織受到基質(zhì)不均勻影響的主要表現包括陰陽(yáng)面，成像不均勻等）。因此以成像采集的速 度與效率兼得為主的目標被視為主要的攻克難點(diǎn)之一6。升華法沉積基質(zhì)后的效果請參考 圖片1(Figure 1)，基質(zhì)附著(zhù)均勻，組織輪廓清晰。使用QuanTOF MS進(jìn)行成像采集，空 間分辨率為10 μm的完整大鼠鼠腦成像數據 (質(zhì)量校準點(diǎn)數據除外) 共計120 GB，采集總時(shí) 長(cháng)約4小時(shí)20分鐘?？傮w質(zhì)量出峰分辨率 (Resolution) 可達到同位素峰間分離 (Figure 2) ，低質(zhì)量區域可達到基線(xiàn)分離。單譜圖平均分辨率可達1.5K+，最高可達2K+。譜圖上組 織內區別性表達的分子出峰信息豐富，質(zhì)量精度可達到0.25 Da (250 ppm) 以?xún)?。從成?結果上可見(jiàn)單分子在組織結構的區別性分布，成像完整，區域細節化清晰且空間分辨率 良好 (Figure 3 & 4)?；谫|(zhì)譜成像的7s指標，2020年質(zhì)譜成像專(zhuān)家Dr. Marvin Vestal 提 出的全新概念4，以標準化質(zhì)譜成像的采集儀器的性能及特點(diǎn)。通過(guò)此次實(shí)驗的驗證，質(zhì) 譜成像結果達到7s標準
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Figure 2: The spectrum with high resolution performed in IMS (Negative Ion Mode).
A. Single spectra with 10 laser shots. B. The accumulated spectrum selected from the region of cerebellum.
C. the cerebellum region selected for generation spectrum B.
7s 指標
Speed 速度
速度指標由多個(gè)采集參數共同決定，主要包含高激光頻 率(High Laser Rate = 5 kHz)，激光掃描速度 (Motion of Sample Relative to Laser Beam = 5 mm/s)，高離子化效率 (High Ionization Eff iciency ~ 50%)，高速采集，處理&質(zhì)譜數 據保存速率 (High Rate ~ 500 spectra/s)。速度的局限性也與 樣本采集的質(zhì)量范圍，組織樣本處理后的分子濃度與空間分 辨率直接相關(guān)。我們此次結果的采集基于QuanTOF MALDITOF MS Imaging 可達到的最高成像采集速度500 pixel/s (with 10 laser shots/pixel)，平均采集速度 300 pixel/s。
Specificity 質(zhì)量精確度
質(zhì)量精確度與質(zhì)量分辨率有關(guān)，受到儀器本身的功能性 與樣本中分子的元素組成 (Elemental Formula) 局限。通過(guò) 校準品的外標法校準，我們可以得到同位素峰的質(zhì)量偏差在 ±0.25 Da (250 ppm) 區間內的準確度。
Figure 3: The single ion chromatogram of the mass of 888.6 Da.
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Sensitivity 靈敏度
質(zhì)譜成像的分子采集靈敏度由離子化效率決定。離子化 效率與樣本本身和基質(zhì)的性質(zhì)直接相關(guān)，即會(huì )受到樣本處理 和實(shí)驗前處理的影響。由微米級的激光光束直徑通過(guò)少次激 光轟擊 (laser shots = 10) 樣本表面使樣本可離子化的分子氣 化，信號強度同樣受到樣本表面的分子濃度影響。
Stability 穩定性
在該次采集的大鼠鼠腦樣本，連續采集空間分辨率10μm 的完整成像共計激光轟擊次數~3千萬(wàn)次 (Total Laser Shots = 33,613,500) 。采集過(guò)程中真空值穩定在8E-7 Torr，離子源 未清洗狀態(tài)下完成采集任務(wù)，激光聚焦保持穩定的10 μm， 采集能量輸出穩定 8 μJ。 在我們的采集中未觀(guān)察到采集過(guò) 程出現明顯波動(dòng)，結果上成像細節呈現均勻。
Spatial Resolution 空間分辨率
空間分辨率直接受到儀器硬件的激光光斑直徑影響。 QuanTOF MALDI-TOF MS Imaging的激光光束聚焦直徑可 以達到10 μm。定制化的儀器的激光光斑小于5 μm。
Simplicity 簡(jiǎn)化性
除去前處理需要手動(dòng)實(shí)驗外，成像采集過(guò)程全部由儀器 自動(dòng)完成。成像采集的方法設置也無(wú)需專(zhuān)業(yè)指引，可自主根 據實(shí)驗所需條件自由且快捷地完成調整。
Size (million pixels) 數據量
除去校準品采集的數據量，該次大鼠鼠腦成像數據量為 ~120GB大小，涵蓋~3百萬(wàn)譜圖 (3,361,350 spectrum)，約3.4 百萬(wàn)像素 (10 μm ×10 μm)。
Figure 4: MSI chromatograms of rat brain detected in negative ion mode (1,5-DAN sublimation, spatial resolution = 10 μm)
結論
基于升華法的MALDI-TOF MS 高分辨率脂質(zhì)成像 基于升華法的 MALDI-TOF MS 高空間分辨脂質(zhì)分子成像 金佳薏，宋合興 —— 應用研發(fā)部 融智生物科技（青島）有限公司 簡(jiǎn)介 MALDI 質(zhì)譜成像技術(shù)因其獨特的技術(shù)優(yōu)勢，包括實(shí)現多樣的分子 類(lèi)型，復雜樣本上的分子空間分布等，已被多領(lǐng)域的研究引用。質(zhì)譜 成像的標準化前處理及采集成像的儀器性能標準均是衡量和決定成像最 終質(zhì)量的關(guān)鍵。在此篇紀要中，根據我們標準的升華法前處理流程及采 集流程可以得到高效率和高分辨率的脂類(lèi)成像結果。通過(guò)我們的成像結 果可直觀(guān)觀(guān)察到多樣性的脂類(lèi)分子在復雜腦組織結構中的細節展現， 為進(jìn)一步分析不同脂類(lèi)分子的功能與結構性意義提供了基礎與可能。
參考文獻
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